Avaliação da qualidade e da estabilidade de amostras de soro humano para análise e armazenamento em biorrepositório / Evaluation of the quality and the stability of human samples for analysis and storage in biorepository

Objetivo: O Estudo das Condições de Vida e Saúde de Pomerode, SC (SHIP-Brasil), conduzido pela Universidade Regional de Blumenau, visa estratificar os fatores de risco e genéticos eventualmente existentes na gênese das mais variadas doenças. Para tal são necessários exames laboratoriais, antropométricos, genéticos e de imagem para a definição das mesmas e o acompanhamento de sua evolução. Este trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade das amostras armazenadas no biorrepositório do estudo, que podem ser utilizadas para pesquisas de biomarcadores no futuro. Métodos: Foram avaliadas amostras de soro em jejum de 56 voluntários. Os analitos estudados foram glicose, colesterol total, creatinina e transaminase glutâmico-pirúvica (ALT), após 1, 2 e 3 anos de armazenamento a -80ºC. Os resultados foram analisados com o Teste t de Student e de acordo com o Erro Permitido Máximo para cada analito. Resultados: Não encontramos evidências de que as amostras do Estudo SHIP-Brasil possam perder a sua qualidade após serem armazenadas por longos períodos. Conclusão: Os Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) estabelecidos estão adequados para o processamento e preservação das amostras.

Impacto de métodos de preservação na caracterização por taxonomia polifásica de isolados de sporothrix spp / Impact of preservation methods on polyphasic taxonomy characterization of sporothrix spp isolates

Os métodos de preservação empregados em micologia buscam manter a viabilidade e a estabilidade das características fenotípicas e genéticas. Entretanto, alterações podem ocorrer dependendo da metodologia empregada. Atualmente são escassos os dados da estabilidade dos isolados de Sporothrix spp., incluindo perfis fenotípicos, genotípicos e proteômicos após o armazenamento. Com a recente descrição das novas espécies patogênicas, para o homem e outros mamíferos, torna-se necessário o armazenamento desses fungos em coleções de culturas para estudos futuros, possibilitando maior conhecimento sobre a taxonomia, fisiologia e virulência de Sporothrix spp. Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar métodos de preservação que permitam manter a estabilidade dos perfis fenotípicos, genotípicos e proteômicos dos isolados de Sporothrix spp.. Com esse propósito foram utilizados 8 isolados de Sporotrix spp., armazenados por três diferentes métodos. Preservação em água destilada, sob refrigeração a 4ºC e criopreservação a -80°C, por períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de armazenamento. Os isolados foram identificados pelo sequenciamento parcial dos genes calmodulina e ß-tubulina e pela PCR fingerprinting. A estabilidade do fenótipo foi realizada, por meio das provas fenotípicas sugeridas na chave de identificação das espécies de Sporothrix spp. que incluem: morfologia dos conídios, diâmetro da colônia a 30°C, teste de termotolerância a 37°C e assimilação de carboidratos, glicose sacarose e rafinose. O dimorfismo também foi avaliado após a preservação. A estabilidade genotípica foi realizada por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da ß-tubulina

A estabilidade proteômica foi realizada por espectrometria de massa (MALDI-TOF MS), após 24 meses de preservação. Todos os isolados foram recuperados dos três métodos em todos os períodos avaliados. No entanto, os isolados preservados em água destilada apresentaram contaminações. Alterações morfológicas foram observadas após preservação a -80°C, um isolado deixou de apresentar colônia pigmentada e conídios demáceos. O diâmetro das colônias assim como a termotolerância permaneceram estáveis nos três métodos. A principal alteração ocorreu com o perfil de assimilação de carboidratos e essa variação modificou a identificação das espécies pela chave taxonômica. A estabilidade genotípica para o gene codificador da ß-tubulina foi preservada após 24 meses em ambos os métodos de armazenamento. Entretanto, baixo polimorfismo foi detectado após preservação em água destilada. Os isolados foram identificados corretamente por espectometria de massa após o armazenamento, porém alterações no perfil protéico foram observadas. O método de preservação a 4°C foi o mais efetivo para preservar os isolados de Sporothrix spp., manteve estável a maioria das características fenotípicas, como também a estabilidade do genótipo por até 24 meses de armazenamento. Esse é um método simples e de baixo custo que pode seu usado em laboratórios de recursos limitados como, um método alternativo de preservação. (AU)

Qualificação do transporte de amostras para o monitoramento da qualidade de água tratada para uso em diálise / Qualification of the sample transport for monitoring the quality of water for dialysis purpose

As condições de coleta e o transporte das amostras de água tratada para uso em diálise são etapas críticas para garantir a qualidade dos resultados analíticos. A temperatura no transporte de amostras deve assegurar a manutenção das características físicas e biológicas desde a coleta até o recebimento pelo laboratório analítico. O objetivo deste estudo foi de qualificar o transporte de amostras de água tratada para diálise desde os Serviços de Diálise do estado de São Paulo até o Instituto Adolfo Lutz, realizado durante a execução do Programa Estadual de Monitoramento. Os resultados obtidos indicaram que o sistema adotado, utilizando-se caixas isotérmicas e gelo reutilizável, é capaz de garantir as condições adequadas de temperatura durante o transporte do ponto de coleta das amostras até o laboratório analítico.

The conditions for collecting and transporting the dialysis water samples are the critical steps to assure the quality of the analytical results. The temperature during the water samples transport should ensure the maintenance of the physical and biological characteristics of samples from their collections to the analytical laboratory. The objective of this study was to qualify the transport of the dialysis water samples from the Dialysis Services of the state of São Paulo to the Adolfo Lutz Institute, during the performance of the State Monitoring Program. By using the isothermal boxes and the reusable ices, the obtained results indicated that the adopted system were able to guarantee the adequate temperature conditions during the transport from the sample collection point to the analytical laboratory.

Avaliação de terapias imunossupressoras em transplantes renais com uma abordagem metabolômica / Assessment of immunosuppressive therapies with a metabolomic approach

O aprimoramento das técnicas analíticas viabilizou a metabolômica, uma área da ciência que busca compreender, de forma comparativa, os metabólitos envolvidos nas vias bioquímicas. A metabolômica está inserida no contexto das "ômicas", que teve início na "Era Genômica", a qual permitiu a identificação de diversos genes. Em seguida, o interesse dos pesquisadores centrou no estudo dos metabólitos (metabolômica) mostrando ser uma ferramenta valiosa na pesquisa do transplante renal, que exige um tratamento medicamentoso por meio de imunossupressores. A combinação destes imunossupressores pode minimizar a rejeição do órgão transplantado, reforçando a necessidade de um estudo metabolômico, a fim de avaliar e comparar as mudanças ocorridas após o transplante em nível molecular, melhorando o conhecimento sobre a influência destes regimes e dando subsídios sobre prognósticos possíveis na área de transplante renal. Nesta tese foram avaliadas 2 terapias: Everolimo/ Prednisona/Tacrolimo (grupo 1) e Micofenolato mofetil/Prednisona/Tacrolimo (grupo 2) a partir de uma abordagem untargeted. No presente trabalho foram coletadas amostras de urina de pacientes ao longo de 6 meses. Foi necessário determinar a melhor condição para análise das amostras de urina dos pacientes. Desta forma, foram realizados estudos sobre alguns parâmetros que impactam no preparo de amostra abordando a influência da urease, tipos e proporção de solventes para precipitação de proteína, seleção do melhor agente derivatizante e tratamento de dados. A avaliação da medida de qualidade dos tratamentos com urease foi feita a partir do desvio padrão relativo (RSD) dos valores de intensidade de pico. A concentração de 10 mg mL-1 apresentou o melhor resultado. O estudo mostrou também que o teor de ureia na urina pode influenciar na identificação dos compostos. O número de compostos identificados foi menor quando a urina não foi tratada com urease, com aproximadamente 10 compostos a menos em relação à amostra tratada com a enzima, na mesma concentração de ureia adicionada. Dos solventes orgânicos testados para precipitação de proteínas nas amostras de urina, o isopropanol mostrou ser o solvente mais adequado na proporção 1:6 urina:solvente (v/v), utilizando-se 100 µL de urina. Foram testados dois protocolos de derivatização para análises por GC-MS: metoximação e sililação utilizando BSTFA e cloroformiato de metila. A comparação mostrou que o procedimento por BSTFA, com 40 metabólitos identificados, foi superior ao cloroformiato de metila, com 13 compostos identificados. No tratamento de dados com o software XCMS, os seguintes parâmetros foram avaliados: largura a meia altura do pico (fwhm), largura da banda (bw) e threshold (sntresh). Para avaliar a melhor combinação destes parâmetros, foi feita uma variação univariada destes valores. A qualidade do resultado de cada combinação foi monitorada pelos valores gerados de número de missing values, quantidade de picos com RSD <15% e número de valores duplicados. Os valores ótimos foram obtidos para a combinação: fwhm=4, bw=2 e threshold=5. A abordagem do estudo dos dois grupos de pacientes baseou-se inicialmente na comparação entre o dia 7 da terapia com os demais períodos (dia 14, mês 1, mês 3 e mês 6) e posteriormente avaliou-se a evolução temporal. A partir do mês 3 os valores de correlação e predição dos modelos de PLS-DA são melhores e já é eficaz na diferenciação entre os dois grupos. Foram observadas perturbações no metabolismo de carboidratos em ambos os grupos, como açúcares, glicerol e N-acetil-D-manosamina. No grupo 1, foram observados metabólitos discriminantes da classe dos poliois e das vias do ciclo do ácido cítrico e degradação de xenobióticos, enquanto que, no grupo 2, foi observada alteração do hidroxibutirato, um corpo cetônico. Neste grupo, foi observado também um aumento do ácido hipúrico, ácido acetamido butírico, ácido benzoico, entre outros. Nesta tese foi possível demonstrar que a metabolômica é uma ferramenta importante para comparar metabólitos discriminantes entre dois regimes imunossupressores, sendo um estudo piloto que visa fornecer subsídios para avaliação da influência destas terapias no prognóstico de transplante renal

The improvement of analytical techniques enabled the emergence of metabolomics, which aims to compare the metabolites involved in biochemical pathways, in certain biological conditions. Metabolomics is inserted in the "omics" context, which began in the "Genomic Age", and allowed the identification of several genes. After that, the researchers focused on the study of metabolites. Among several applications, metabolomics can be a valuable tool in renal transplant research, which requires a drug treatment through immunosuppressants. The combination of these immunosuppressants can minimize toxicity and rejection of the transplanted organ, reinforcing the need for a metabolomic study, in order to evaluate and compare changes after transplantation at the molecular level, improving knowledge about the influence of these regimens and giving subsidies on prognosis in the area of renal transplantation. In this thesis two immunosuppressive therapies were evaluated by an untargeted approach: Everolimus/Prednisone/Tacrolimus (group 1) and Mycophenolate mofetil/Prednisone/Tacrolimus (group 2). In this study, urine samples were collected from patients over 6 months. It was necessary to determine the best condition for analysis of patients' urine samples. Thus, studies were carried out on some parameters that impact on sample preparation, evaluating the influence of urease, types and proportion of solvents for protein precipitation, selection of the best derivatizing agent, and data treatment. The evaluation of the quality measure of the urease treatments was made from the relative standard deviation (RSD) of the peak intensity values. The concentration of 10 mg mL-1 presented the best result. The study also showed that urine urea content may influence the identification of the compounds. The number of identified compounds was lower when urine was not treated with urease, with approximately 10 compounds less than the enzyme-treated sample, at the same concentration of urea added. In the evaluation of the organic solvents tested for protein precipitation in the urine samples, isopropanol was the most suitable solvent in the ratio 1: 6 urine:solvent (v/v), using 100 µL of urine. Two derivatization protocols were tested for GC-MS analysis: metoximation and silylation with BSTFA and methyl chloroformate. The comparison between the two derivatization protocols showed that the BSTFA procedure, with 40 identified metabolites, was superior to methyl chloroformate with 13 compounds identified. In data processing with the XCMS software, the following parameters were evaluated: full width at half maximum of the peak (fwhm), bandwidth (bw) and threshold (sntresh). To evaluate the best combination of these parameters, a univariate variation of these values was made. The quality of the result of each combination was monitored by the number of missing values, number of peaks with RSD <15%, and number of duplicate values. The optimal values were obtained for the combination: fwhm=4, bw=2 and threshold =5. The study of the two groups of patients was initially based on the comparison between day 7 of the therapy with the other periods (day 14, month 1, month 3 and month 6) and later the temporal evolution was evaluated. From month 3 the values of correlation and prediction of the PLS-DA models are better and already effective in the differentiation between the two groups. Disorders in carbohydrate metabolism were observed in both groups with sugars and glycerol and N-acetyl-D-mannosamine as discriminant metabolites. In group 1, discriminant metabolites of the class of polyols and citric acid cycle pathways and degradation of xenobiotics were observed, and in group 2 alteration of hydroxybutyrate, a ketone body, was observed. In this group an increase of hippuric acid, acetamido butyric acid, benzoic acid, among others, was also observed. In this thesis it was possible to demonstrate that metabolomics is an important tool to compare discriminant metabolites between two immunosuppressive regimens, being a pilot study that aims to provide future subsidies to evaluate the influence of these therapies on the renal transplant prognosis

Manual de normas y procedimientos para la toma de muestras y su envío al Laboratorio Nacional de Salud / Manual of standards and procedures for taking samples and sending them to the National Health Laboratory

"Este manual tiene el objetivo de dar a conocer el procedimiento para la toma, almacenamiento y transporte de muestras al LNS así como los conceptos básicos de Bioseguridad. Es de utilidad para personal de laboratorio, enfermería, epidemiología, clínicos y otros que intervienen en este proceso." Incluye un correo electrónico y número telefónico para cualquier consulta en relación al tema. Contiene además, las definiciones de los conceptos relacionados al tema principal, además de la infraestructura que deberá tener el transporte de muestras, incluidos el equipo y el manejo de las mismas. Especifica procedimiento para la toma de muestras de varias enfermedades, entre ellas: Rotavirus, Enfermedad diarreica aguda de etiología bacteriana, Cólera, Fiebre Tifoidea, Hepatitis A, B o C, Dengue, Chikungunya, entre muchas más. En los anexos, incluye los códigos geográficos departamentales y municipales (como herramienta para la identificación de personas con VHI) También contiene en la sección de anexos, una lista de "Laboratorios que realizan cultivos de microbacterias" en el país. Además incluye "Fichas epidemiológicas" de distintas enfermedades

Avaliação d qualidade do DNA obtido de amostras preservadas em parafina / Quality evaluation of DNA from samples preserved in parafin

A obtenção de um material genético íntegro e com concentrações satisfatórias para a amplificação de de uma determinada sequência são os principais desafios para o processamento de amostras de tecido preservados em parafina. O presente estudo teve como objetivo comparar três diferentes protocolos de extração de DNA que têm em comum entre si o princípio de extração por silica-gel. Vinte e sete amostras de tecidos tireoidianos preservados em parafina foram processadas por meio de cortes em triplicata de 20um. O método A utilizou tr~es horas na etapa de digestão do tecido, os métodos B e C utilizaram 16 horas para a digestão, sendo que o último utilizou diferentes solventes para reidratar o tecido e solução de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico para purificação. Todos os métodos utilizaram em comum o conjunto de reagentes QIAamp DNA mini kit. Na comparação entre as concentrações obtidas de DNA, o método B spresentou maior média (3,7 ng/iL) já o método A obteve valor médio que 1,2 ng/uL e o método C, de 0,7 ng/uL. Todos os protocolos obtiveram valores da relação 260/280 e 260/230 fora dos valores de refer~encia esperado, evidenciando uma perda na qualidade do DNA extraído. O resultado da integridade do DNA, por meio de eletroforese em gel agarose também demonstrou o alto grau de degradação de todos os métodos analisados. Entretanto, foi possível realizar a genotipagem do polimorfismo 174G>C do gene da interleucina 6 em 100% das amostras testadas para o método C, e 66% par a o método A e B. O método C foi o mais reprodutivo para genotipagem , apesar do maior custo e tempo de processamento, sendo este método mais indicado para a implementação na rotina laboratorial de biologia molecular para amostras preservadas em parafina.

Recobrado de Shigella spp. conservada por la técnica de secado en perlas de vidrio / Recovery of Shigella spp. preserved on glass beads by dehydration technique

Introducción: la técnica de secado en perlas de vidrio se reporta como método de conservación microbiana desde hace varios años, pero la información existente es limitada. Con este antecedente, se decidió evaluar su utilidad para conservar bacterias, de origen clínico, en la colección de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología. Métodos: se estudiaron dos cultivos de Shigella spp., mantenidas en refrigeración. Los datos de viabilidad obtenidos durante cuatro años de conservación fueron procesados con el paquete estadístico SPSS versión 15.0. El análisis estadístico incluyó el de la varianza para la comparación de las medias del recobrado de células viables para las variables tiempo de conservación, dilución y mezcla preservante, y el test de Scheffé de comparaciones múltiples post hoc para la discriminación de las medias. Fueron controladas las características fisiológicas y la respuesta a la tinción de Gram de las cepas. Resultados: no se encontraron diferencias significativas entre las mezclas preservantes utilizadas en este ensayo, y pudieron recobrarse ambas cepas durante los cuatro años de estudio. A partir de los seis meses se apreció una disminución del efecto protector en todas las mezclas. Se obtuvo variabilidad en algunos caracteres fisiológicos (indol, dulcitol y manitol), pero no para la respuesta a la tinción de Gram en ambas cepas, la que se mantuvo estable. Conclusiones:: el método resultó apropiado para mantener Shigella spp. por tiempo limitado, pero pudiera utilizarse como alternativa de conservación en laboratorios con limitados recursos a corto plazo, por su sencillez, bajo costo y efectividad, y debe garantizarse la disponibilidad de réplicas por otras técnicas

Introduction: glass bead dehydration technique has been reported as a microbial preservation method for some years, but the available information is limited. Based on this antecedent, it was decided to evaluate its usefulness to preserve bacteria of clinical origin in the collection of microbial cultures at the National Institute of Hygiene, Epidemiology and Microbiology. Methods: a study was conducted of two Shigella spp. cultures kept under refrigeration. The viability datas obtained during four years of preservation were processed with the statistical package SPSS, version 15.0. Statistical processing included analysis of variance for comparison of the mean recovery values of viable cells for the variables preservation time, dilution and preserving mix, and Scheffe's test of post hoc multiple comparisons for means discrimination. Physiological characteristics were controlled, as well as the response of strains to Gram stain. Results: no significant differences were found between the preserving mixes used in the trial, and both strains could be recovered during the four years of the study. The protective effect of all mixes was found to decrease after six months. Variability was obtained for some physiological characters (indol, dulcitol and mannitol), but response to Gram stain remained stable in both strains. Conclusions:: the method was found to be suitable to preserve Shigella spp. for a limited time, but it could be used as a short-term preservation alternative in laboratories with few resources, due to its simplicity, low cost and effectiveness. Availability should be ensured of replicas obtained by other techniques

Estudio de dos sistemas de transporte para mantener la viabilidad de bacterias de interés clínico / Study of the ability of two swab transport systems to maintain viability of clinically important bacteria / Estudo de dois sistemas de transporte para manter a viabilidade de bactérias de interesse clínico

Se compararon dos dispositivos de conservación de muestras tomadas por hisopado con cepas de referencia de Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae (ambos con medio de Stuart). El dispositivo Copan Venturi Transystem® (Copan Italia Spa, Brescia, Italia) resultó ser significativamente más efectivo que el Eurotubo (Deltalab, Rubí, Barcelona, España) probablemente porque la estrangulación que presenta al comienzo de la columna semisólida (sistema tipo Venturi) permitiría una mejor conservación de los microorganismos.

Two extendedly-used swab transport devices with Stuart medium using Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae and Streptococcus pneumoniae reference strains, were compared. Copan Venturi Transystem® (Copan Italia Spa, Brescia, Italy) was significantly more effective than Eurotubo (Deltalab, Rubí, Barcelona, Spain), probably because the narrowing of the tube, just at the beginning of the semisolid column (Venturi system), would yield a better conservation of diffrerent organisms.

Foram comparados dois dispositivos de conservação de amostras tomadas por swab com cepas de referência de Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae e Streptococcus pneumoniae (ambos com meio de Stuart). O dispositivo Copan Venturi Transystem® (Copan Italia Spa, Brescia, Itália) resultou ser significativamente mais efetivo que o Eurotubo (Deltalab, Rubí, Barcelona, Espanha) provavelmente porque o estrangulamento que apresenta no início da coluna semi-sólida (sistema tipo Venturi) permitiria uma melhor conservação dos microorganismos.

Perfil das amostras do sistema nervoso central de bovinos com síndrome neurológica e diagnóstico da raiva bovina no serviço de defesa sanitária de Minas Gerais, 2003-2010 / Profile of central nervous system samples from cattle with neurological syndrome and diagnosis of bovine rabies by the service of sanitary defense of Minas Gerais, 2003-2010

As enfermidades do sistema nervoso central (SNC) são frequentemente relatadas em bovinos no Brasil. Apesar de Minas Gerais ter o segundo maior rebanho bovino do país, há escassez de informações referentes às doenças neurológicas que acometem esses animais. O Laboratório de Saúde Animal do Instituto Mineiro de Agropecuária (LSA/IMA) é o responsável pelo diagnóstico das enfermidades neurológicas dos animais de produção no Estado, com ênfase para a raiva e as encefalopatias espongiformes transmissíveis. Foi realizado um estudo retrospectivo dos dados referentes às amostras de SNC de bovinos com síndrome neurológica avaliadas pelo LSA/IMA de janeiro/2003 a junho/2010, com o objetivo de determinar o perfil das amostras encaminhadas para análise no serviço de defesa sanitária animal, com ênfase no diagnóstico da raiva bovina. Foram consideradas características do animal (sexo, idade, raça e tipo de morte) e da amostra (método de conservação e responsável pela coleta), sendo nas positivas para raiva, avaliada sua composição, assim como as alterações histopatológicas encontradas. Os dados relacionados à frequência de positividade nas diferentes categorias foram submetidos à análise pelo Teste Exato de Fisher. Durante o período avaliado, foram analisadas 3.731 amostras de bovinos com doença neurológica, havendo predomínio de fêmeas e mestiços, o que reflete a composição do rebanho do Estado. O método de conservação foi o principal problema encontrado, sendo apenas 25,89% das amostras encaminhadas em gelo e formol a 10%. Verificou-se uma diminuição gradativa no envio de material para análise. Quanto a raiva bovina diagnosticada no Estado, foram avaliadas 3.703 amostras pela imunofluorescência direta (IFD) e prova biológica (PB), com 41,58% de positividade, sendo dessas 282 submetidas a histopatologia. A frequência de positividade foi influenciada pela raça, idade e tipo de morte do animal. A composição da amostra alterou significativamente o resultado das análises, havendo maior frequência de positividade naquelas compostas por três ou mais fragmentos de SNC, tanto na IFD/PB, quanto na histopatologia. O bulbo, fragmento de eleição para o diagnóstico da EEB, tem sido erroneamente enviado refrigerado e não em formol a 10%. Cerebelo, tálamo, tronco encefálico e medula apresentaram maior frequência de corpúsculos de Negri que cérebro e gânglio trigeminal. O infiltrado inflamatório não supurado foi menos frequente no cérebro, que nos demais fragmentos avaliados. Conclui-se que as amostras de bovinos com síndrome neurológica enviadas ao serviço de defesa sanitária animal de Minas Gerais apresentam características distintas, sendo o método de conservação o principal problema encontrado. Além disso, a raiva bovina diagnosticada na população estudada é influenciada pelas características do animal e da amostra, sendo indicado o envio de diferentes fragmentos do SNC para análise, conservados adequadamente, o que contribui para um diagnóstico mais preciso.(AU)

Diseases of the central nervous system (CNS) are often reported in cattle in Brazil. Although the State of Minas Gerais has the second largest cattle herd in the country, there is little information from this state concerning neurological diseases that affect cattle. The Laboratório de Saúde Animal of the Instituto Mineiro de Agropecuária (LSA/IMA) is in charge of the diagnosis of neurological diseases of livestock in the State, with emphasis on rabies and transmissible spongiform encephalopathies. A retrospective study was conducted on data from cattle with neurologic diseases evaluated by the LSA/IMA from January/2003 to June/2010, aiming to determine the profile of CNS samples sent for analysis, with emphasis on the diagnosis of bovine rabies. Issues related to the animal (sex, age, breed and type of death) as well as to the sample (method of conservation, person in charge the collection, and region of the CNS sampled) were evaluated. Data on frequency of rabies positive samples were analyzed by Fisher's exact test. During the period studied, 3,731 samples from cattle with neurological signs were analyzed, with a predominance of females and crossbred cattle. The method of preservation was the main problem encountered with only 25.89% of samples sent both refrigerated and fixed in 10% formaldehyde. There was a gradual decrease in submission of samples during the course of this study. All 3,703 samples were evaluated by direct fluorescent antibody test (DFA) and biological test (BT) for rabies, 41.58% being positivity for rabies, and 282 of those samples being subjected to histopathology examination. The frequency of positivity was influenced by breed, age, and type of death. Composition of the sample significantly influenced the results, with higher frequency of positivity in samples containing three or more CNS fragments by DFA, BT, or histopathology. The medulla, which is the fragment of choice for diagnosis of BSE, has often been mistakenly submitted under refrigeration, but not in 10% formalin. Cerebellum, thalamus, brain stem, and spinal cord had higher frequency of Negri bodies than the cerebral cortex and trigeminal ganglia. The nonsuppurative inflammatory infiltrate was less frequent in the cerebral cortex than in other CNS fragments. In conclusion, CNS samples from cattle with neurological syndrome sent to the animal health protection service of Minas Gerais are heterogeneous, and the preservation method was the major problem hindering and adequate diagnosis. In addition, diagnosis of rabies was influenced by parameters of the animal as well as the CNS sample. Submission of properly preserved fragments from various segments of the CNS contributes to a more accurate diagnosis of rabies in cattle.(AU)

Estudios de nuevas tecnicas para conservación de piezas anatómicas / Study of new techniques for the preservation of anatomical pieces: plastination

Introducción: la conservación de las piezas cadavéricasen formol con fines docentes ha sido y lo es en la actualidaduna preocupación compartida por los docentes de la Facultadde Ciencias Médicas.Objetivos: eliminar los riesgos sanitarios; mejorar lacalidad del material; obtener piezas anatómicas que conservensu flexibilidad; favorecer el contacto directo de los estudiantescon las estructuras a estudiar; mejorar la calidad de las piezasanatómicas del Museo Anatómico Pedro Ara.Material y métodos: se trabajó en material cadavéricoanimal, con estructuras pequeñas que facilitan la aplicaciónde la técnica de impregnación en silicona de especímenesenteros o cortes, obteniendo apariencia natural de preparadoselásticos y flexibles.Resultados: se obtuvo piezas con elasticidad, flexibilidady conservación de la coloración. Permitió realizar preparadossin uso de formalina.Conclusión: afirmamos que la plastinación permiteconservar y manipular estructuras anatómicas con seguridad,sin necesidad de utilizar formol u otro elemento tóxico

Introduction: Formaldehyde preservation of body parts for study purposes has alwaysbeen a concern shared by teachers at the School of Medicine.Objectives: To eliminate health risks; improve the quality of samples; obtain anatomicalpieces which keep flexibility; help students’ direct contact with the structures to be studied;and to improve the quality of anatomical pieces at the Anatomical Museum Pedro Ara.Material and methods: We worked on cadaverous animal material with small structuresthat facilitate the application of the technique of silicon impregnation of complete orsectioned specimens obtaining elastic and flexible preparations with natural appearance.Results: We obtained elastic flexible pieces with color conservation. It was possible toprepare samples without formalin.Conclusion: We assert that plastination allows the safe preservation and manipulationof anatomical structures, with no need to use formaldehyde or other toxic element

Tissue preservation and cell culture of Przewalskii´s horse (Equus przewalskii): an endangered species / Preservação de tecidos e cultura de células do cavalo de Przewalski (Equus przewalskii): uma espécie em extinção

The Przewalskii´s horse or Mongolian wild horse (Equus przewalskii, Poljakov, 1881) is presently the only species of wild horse in existence. Originally from Asia, it is, classified as in extremely high risk of extinction which puts the species in the seriously threatened category. The aim of this work was the preservation of tissues and the development of cell cultures from tissue samples obtained from a Przewalskii´s horse after its death. Biopsies of skin, skeletal and cardiac muscle, and ear cartilage were removed from a recently dead horse, added to Phosphate Buffer Saline (PBS) and refrigerated until processing. Some of the samples were frozen in liquid nitrogen and the other was grown as explants to generate fibroblast cell monolayers. The cell cultures obtained, were subsequently propagated with low passages, and frozen in liquid nitrogen, thus avoiding genetic and phenotypic alterations. The tissues and cell cultures were thawed to ascertain their viability by checking its progressive grow in a flask. It was not possible to obtain cultures from cardiac muscle. A bank of tissues and cells from the single Przewalskii´s horse that existed in Uruguay was generated, and can be used for scientific purposes and for the conservation of the species in the future

Manual de toma, conservación, transporte y envío de muestras / Manual collection, preservation, transport and shipment of samples

El objetivo de este manual es brindar al personal de laboratorio conceptos básicos para la toma, conservación, transporte y envío de las muestras describiendo el material necesario,la técnica de obtención, volumen, número y transporte de cada una de ellas, según las distintas localizaciones y características especiales de aquellas o de los microorganísmos y/o metabolitos a investigar.

Detección molecular de complejo mycobacterium tuberculosis frente a baciloscopia y cultivo en muestras de lavado borncoaveolar para tuberculosis pulmonar / Molecular detection of mycobacterium tuberculosis complex against baciloscopy and cultivation for the diagnostic of lung tuberculosis

La utilidad de la baciloscopia, cultivo en medio Lowestein Jensen y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) fue evaluada en 35 muestras obtenidas del lavado broncoalveolar (LBA) mediante fibroncoscopia, provenientes de pacientes de ambos sexos, sin distinción de grupo étnico y edades comprendidas entre los 26 y 78 años, con manifestaciones clínicas y/o, hallazgos radiológicos sugestivos de tuberculosis pulmonar en el periodo 2008-2009 en el servicio de neumología del Complejo Hospitalario San Pablo Sede Surco. A todas las muestras, se les practicó baciloscopia utilizando la técnica de colaboración de Ziehl-Neelsen. Se utilizó el medio de cultivo Lowestein Jensen como estándar. Los objetivos para el ensayo de RCP fueron los genes que codifican la proteína de 123pb y la secuencia de inserción IS6110. Del total de muestras examinadas por el método de Ziehl-Neelsen, 20 resultaron positivas y 15 resultaron negativas (57,14 y 42,85 por ciento respectivamente). De las 35 muestras sembradas 22 (62,85 por ciento) resultaron positivas y 13 (37,14 por ciento) fueron negativas al cultivo. De todas las muestras amplificadas, 25 (71,42 por ciento) mostraron la presencia de fragmentos de ADN correspondientes tanto a la secuencia de inserción IS6110, mientras que en 10 (28,57 por ciento) no se detecto la presencia de ADN micobacteriano por el método de RCP. La sensibilidad de la prueba RCP fue virtualmente de 100 por ciento y su especificidad fue del 75 por ciento. Se demostró que el RCP, basado en la amplificación simultánea del elemento de inserción IS6110 y del gen que codifica en la proteína 123pb puede identificar infecciones por micobacterias a partir de muestras obtenidas mediante lavado broncoalveolar por fibrobroncoscopia. Se concluye que esta técnica es más sensible que los procedimientos bacteriológicos de rutina (examen directo y cultivo) y la convierten en una herramienta muy poderosa para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar y otras enfermedades micobac...

The utility of baciloscopy, cultivation and Polimerasa Chain Reaction of (PCR) was evaluated in 35 samples from fobrobroncoscophy, of patient of patient of both sexes, without distinction of etnial group and ages between 26 and 78 years, with clinical manifestations, and/or discoveries radiological data of lung tuberculosis. To all the samples they were practiced baciloscopy using the technique of Ziehl-Neelsen. The Lowenstein Jensen cultivation was used like standard. The objectives protein 123pb and the insertion sequence IS6110. Of the total of samples examined by the Ziehl-Neelsen method, 20 were positive and 15 were negative (57.28 and 42 per cent respectively). 22 samples (54.28 per cent) were positive and 13 (45.71 per cent) were negative to the cultivation. Of all amplified samples, 25 (71.42 per cent) showed the precense of fragments corresponding to DNA so much to the sequence of insert IS6110, while in 10 (28.57 per cent) presence of DNA mycobacterium was not detected for RCP method. The sensibility of the RCP test was virtually 100 per cent and its specificity was of 75 per cent. It was demonstrated that RCP, based on the simultaneous amplification of the insertion element IS6110 and the gene that codes the protein 123pb, can identify mycobacterium infections. We conclude also that is more sensitive that routine bacteriological procedures (direct exam and cultivation) and can be a very powerful tool for the diagnosis of lung tuberculosis and other mycobacterium diseases.

Estrategias y procedimientos para la conservación de bacterias de importancia en cavidad bucal / Strategies and procedures for the preservation of important bacteria in the oral cavity

La conservación o preservación de microorganismos es extremadamente importante, y debe garantizar el mantenimiento del organismo en estado inactivo, puro, sin variaciones ni mutaciones, es decir, en una condición muy cercana a la original. La preservación de microorganismos también es una urgente necesidad en los procesos de enseñanza, en taxonomía y en los laboratorios de investigación para múltiples propósitos en estudios metabólicos, genéticos, epidemiológicos, inmunológicos, fisiológicos y patológicos. El costo de la conservación y mantenimiento, así como el tiempo durante el cual los microorganismos permanecen viables, determinan la selección de la técnica de preservación. Hoy en día, la mayoría de los métodos empleados en la preservación de microorganismos requieren sistemas de almacenamiento altamente especializados, un gran soporte de equipos tecnológicos, conocimiento y, con frecuencia, ambientes controlados a temperaturas muy bajas. A menudo, la disponibilidad de equipo, el espacio para almacenar y la experiencia propia determinan el método por emplear. Es necesario tener el conocimiento y la experiencia en el manejo de estas metodologías con el fin de hacer el mejor aprovechamiento de los microorganismos confiados a un cepario o institución coleccionadora de microorganismos. En esta revisión se describen las principales características de los métodos de preservación a corto y largo plazo, y la experiencia con éstos en bacterias representativas de cavidad bucal.

Exame do líquido cefalorraquidiano: influência da temperatura, tempo e preparo da amostra na estabilidade analítica / Cerebrospinal fluid exam: influence of sample preparation, temperature and time on analytical stability

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido biológico que está em íntima relação com o sistema nervoso central (SNC). Por isso, o exame do LCR constitui um método de grande valia para o diagnóstico e o acompanhamento de diversas afecções neurológicas. Entretanto, existem poucos estudos sobre a estabilidade de seus analitos durante a etapa pré-analítica. OBJETIVO: Identificar dados existentes sobre a influência da temperatura e do tempo de estocagem, dos ciclos de congelamento/descongelamento e pré-tratamentos (centrifugação, desnaturação, adição de soro) na estabilidade dos analitos do LCR. MÉTODO: Foi realizada uma revisão sistemática de artigos da literatura, usando palavras-chave da língua inglesa como storage, cerebrospinal fluid, CSF, stability, temperature e period, com base nos serviços de dados de PubMed, Highwire Press, Lilacs e Amazonas Library, os quais permitem a pesquisa bibliográfica de citações e artigos científicos. RESULTADO: A busca encontrou nove artigos, resultado da escassez de trabalhos sobre o assunto. Os analitos do LCR estudados incluíram células (número e morfologia), proteínas totais, glicose, lactato, aminoácidos, creatina, creatinina, biomarcadores e enzimas. As metodologias se basearam em microscopia óptica, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), Imunoblot/SDS-PAGE e fotometria. CONCLUSÃO: A revisão da literatura confirma que a estabilidade da amostra de LCR sofre influência da temperatura, do tempo de estocagem e das condições de preparo pré-analítico. Os achados desta revisão sistemática podem contribuir para a ampliação dos conhecimentos no exame do LCR, assim como o melhor entendimento sobre a estabilidade da amostra.

The cerebrospinal fluid (CSF) is a biological fluid that is in close relation with the central nervous system (CNS). Therefore, the CSF examination constitutes an invaluable method in the diagnosis and monitoring of countless neurological diseases. However, there are a few studies about the stability of its analytes during the pre-analytical stage. OBJECTIVE: To identify existing data about the influence of temperature and storage time, freezing/thawing cycles and pre-treatments (centrifugation, denaturation, serum addition) on the stability of CSF analytes. METHOD: A systematic review of articles in the literature was conducted by use of Key words: in English such as "storage", "cerebrospinal fluid", "CSF", "stability", "temperature" and "period", based on data from PubMed, Highwire Press, Lilacs and Amazonas Library, free digital archives of biomedical research articles. RESULTt: The search found nine articles, what results from the lack of studies about this subject. Different CSF constituents were analyzed: number of cells and their morphology, total protein, glucose, lactate, amino acids, creatine, creatinine, biomarkers and enzymes. The methodologies employed were: optical microscopy, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Imunoblot/SDS-PAGE and spectrometry. CONCLUSION: The literature review confirms that the stability of CSF samples is influenced by temperature, storage time and conditions of pre-analytical preparation. The findings of this systematic review may contribute to improving the knowledge about CSF examination, as well as to better understanding the sample stability.

Sisteg®-Sistema de transporte para muestras diagnósticas y sustancias infecciosas / Sisteg®-Transport system for biological material and infectious substances

El propósito de este trabajo es presentar un envase que cumple con las regulaciones de seguridad tanto para el transporte de muestras diagnósticas como el de sustancias infecciosas, basado en las Normas IATA (Asociación de Transporte Aéreo Internacional), en las Recomendaciones para el Transporte de Muestras Peligrosas de Naciones Unidas y en las legislaciones internas vigentes. Este envase logra dar tranquilidad a todos los sectores involucrados en un transporte de muestras: personal del laboratorio derivante, de la empresa de transporte y del laboratorio efector, además de minimizar el riesgo de contaminación del medio ambiente y de la población en general. Por otro lado, también se buscó asegurar la integridad de la muestra, realizando un transporte seguro y eficiente, cuidando la cadena del frío cuando fuese necesario, para permitir un análisis exacto por parte del laboratorio destinatario. Para todo esto se contó con la participación del Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI) el que una vez realizados todos los ensayos, elaboró un documento con los resultados, que permitió a la Comisión de Prevención de Accidentes en la Aviación Civil (PREVAC) -organismo dependiente de las FFAA- determinar que dicho Sistema puede ser utilizado para el envío sin riesgo por vía aérea tanto de muestras diagnósticas como de sustancias infecciosas.

The purpose of the work is to introduce a package that fulfills the safety guidelines for transportation of Diagnostic Specimens as well as Infectious Substances, based on the IATA (Internacional Air Transport Association) Standards, the United Nations Recommendations on the Transport of Dangerous Goods and the internal legislation in force. In this way, none of the sectors involved in Specimen Transportation should not be worried since shipping laboratory personnel, carrier personnel, the receiving laboratory personnel, and, additionally, the risk of polluting the environment or the population in general are minimized. Besides, specimen integrity has been intended to be ensured, by providing safe and efficient transport, taking care of the cold chain when required, in order to obtain an accurate analysis from the receiving laboratory. For this purpose, upon completion of the tests, the Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI - National Institute of Industrial Technology) enabled the Comisión de Prevención de Accidentes en la Aviación Civil (PREVAC - Commission for the Prevention of Civil Aviation Accidents) --dependent on the Air Forces- to set out that said System can be used for sending diagnostic specimens and infectious substances whithout risk by air mail.

Manutenção de leveduras por congelamento a –20ºC / Yeasts mantainance for freezing at –20ºC

As coleções de culturas são especialmente úteis para estudos retrospectivos e prospectivos, que enfocam a biologia, etiologia e aspectos epidemiológicos. Uma vez que estes estudos, geralmente, demandam um longo período de tempo, é importante que se faça escolha adequada do método de preservação. O total de 328 leveduras representadas pelos gêneros Candida, Cryptococcuss, Trichosporon, Rodothorulla foram semeadas em caldo cérebro-coração contendo glicerol e após 7 dias de refrigeração, congeladas – 20ºC. Foram recuperadas 99,0% das leveduras após 3 anos e 3 anos e 6 meses de congelamento. Após o período de 4 anos, a viabilidadefoi de 90,6% (144 leveduras). A metodologia ofereceu a vantagem de baixo custo, facilidade na realização e no armazenamento além de favorecer a conservação de quase totalidade das leveduras por 42 meses.

The culture collections are especially useful for retrospective and prospective studies, which focus the biology, etiologyand epidemic aspects. Once these studies, generally, demand a long period of time, it is important to do the adequate choice of preservation method. The total of 328 yeasts represented by the genus Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rodothorulla were seededin brain-heart infusion contenting glicerol and after 7 days of efrigeration, frozen at –20ºC. It was recovered 99,0% of yeasts after 3 years and 3 years and 6 months of freezing. After the period of 4 years the viability was 90,6% (144 yeasts). The methodology offered the low cost advantage, easiness in the accomplishment and in the storage, besides offering the conservation of almost the totality ofyeasts for 42 months.

Preservação de dermatófitos pela técnica da água destilada estéril / Preservation of dermatophyte fungi by sterile distilled water technique

Fifteen dermatophyte strains preserved by sterile distilled water technique during 11 years in the Fungus Culture Collectionof the Oswaldo Cruz Institute were evaluated in terms of viability and stability of morphological aspects. Of the total number of strains, 14 (93.3%) were viable and no pleomorphic alterations were detected. The distilled water technique showed effective forlong-term laboratory storage of dermatophyte strains.

Quinze cepas de dermatofitos estocadas pela tecnica da agua destilada esteril, por 11 anos, na Colecao de Culturas de Fungos do Instituto Oswaldo Cruz, foram avaliadas quanto a viabilidade e estabilidade dos aspectos morfológicos caracteristicos. Do total de cepas, 14 (93.3%) mantiveram-se viaveis e alterações pleomorficas não foram detectadas. A técnica da água destilada se mostrou efetiva na preservação de cepas de dermatofitos por longos períodos de tempo.

Estabilidad de muestras conservadas en tubo primario: un estudio de 25 analitos de química clínica / Stability of specimens stored in primary tube: a study on 25 analytes of clinical chemistry

Se estudió la estabilidad de veinticinco analitos conservados durante siete días en dos tipos de tubos primarios: tubos de polimetilmetaacrilato (PMMA) con gránulos y tubos con gel separador, ambos con acelerador de la coagulación. El objetivo fue determinar en qué tubo los analitos tenían mayor estabilidad y como consecuencia, cuánto tiempo podían conservarse las muestras en ambos tubos. Las muestras fueron conservadas en el tubo primario a 4-8 ºC y se analizaron por duplicado diariamente durante siete días. La estabilidad de los analitos se determinó comparando los resultados de los siete días con los valores obtenidos el primer día y los límites de aceptabilidad derivaron del coeficiente de variación (CV) de cada determinación, de la variabilidad biológica (VB) intraindividual y de un análisis multivariado de varianza MANOVA. Los promedios de aldolasa, fósforo, glucosa, lactatodehidrogenasa, potasio y sodio cuando la muestra se conservó con gránulos, tuvieron diferencias estadísticamente significativas al compararlos con los promedios de los mismos analitos conservados en gel; resultados similares se obtuvieron cuando se tomó como límite de aceptabilidad el CV y la VB intraindividual. Cada laboratorio debería establecer la estabilidad de sus analitos según el tubo primario utilizado, con el objetivo de responder a no conformidades que requieran el procesamiento de analitos sobre muestras previamente extraídas en el caso de que éstas se conserven en tubo primario.

The stability of 25 analytes during a seven-day storage in two different kinds of tubes was studied. PMMA (polimetilmetaacrilate) tubes contain a clotting activator (glass particles) and the other tubes contain a gel barrier. The aim was to determine the analytes' stability in both kinds of tubes and, as a consequence, to determine the optimal time for storage of the samples in the primary tube. The specimens were maintained at 4-8 ºC and analyzed in duplicate during seven days. The analytes' stability was determined by comparing the results obtained each day with those obtained on the first day. The significant change limits were based on the determination of the variation coefficient, on the biological variation and on statistically significant changes using a MANOVA test. Mean values of aldolasa, phosphate, glucose, lactic dehydrogenase, potassium and sodium stored in tubes with a clotting activator had statistical differences in comparison with the mean values of the same analytes stored with a gel barrier. Each laboratory should investigate the specific analytes' stability according to the collection device used.